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- 產(chǎn)品名稱： 無(wú)縫克隆試劑盒
- 產(chǎn)品貨號(hào)： CSO00037
- 貨期： 現(xiàn)貨
- 價(jià)格與訂購(gòu)： 2800
- 數(shù)量：
庫(kù)存： 100
- 規(guī)格：
- 產(chǎn)品信息
- 如何訂購(gòu)
概述（Summary）icon
產(chǎn)品中文名
無(wú)縫克隆試劑盒
產(chǎn)品描述（Description）
1.產(chǎn)品介紹
無(wú)縫克隆是一種新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技術(shù)，可以同時(shí)將多個(gè)DNA片段克隆到任何載體中,并且最終構(gòu)建的克隆沒(méi)有任何額外的堿基序列，因此被稱作“無(wú)縫克隆”。
和傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，本試劑盒的無(wú)縫克隆技術(shù)有多方面的優(yōu)勢(shì)：（1）操作更簡(jiǎn)單，只需要一次反應(yīng)即可完成；（2）對(duì)酶切位點(diǎn)無(wú)要求，可以把目的片段插入到任意載體的任意位點(diǎn)；（3）連接片段之間不會(huì)引入任何多余的序列，是真正的無(wú)縫克?。唬?）陽(yáng)性克隆率高，降低克隆篩選的工作量。
本試劑盒操作簡(jiǎn)單，僅需將載體在插入位點(diǎn)進(jìn)行線性化，同時(shí)將目的片段兩端引物與載體插入位點(diǎn)同源的15-25bp序列，將線性化的克隆載體和帶有同源序列的PCR片段按合適比例混合，并加入2×Master Mix，在重組酶的催化下，50℃反應(yīng)30min即可快速完成定向克隆，陽(yáng)性率高達(dá)90%以上。試劑盒中2×Master Mix預(yù)混了DNA外切酶、DNA聚合酶、連接酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了特殊的酶激活組分，可顯著提高重組克隆效率，可以一次實(shí)現(xiàn)多至3-6個(gè)片段的順序拼接克隆。
2.試劑盒原理示意圖
2.試劑盒原理示意圖
圖1. 無(wú)縫克隆試劑盒原理示意圖 。 單酶切/雙酶切獲得線性化載體。擴(kuò)增與載體帶有同源臂的目的片段（藍(lán)色和紅色部分為同源部分）。按一定的比例將二者混合在2×Master Mix預(yù)混液中，50℃反應(yīng)30min后直接轉(zhuǎn)化E.coli即可。
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)（Advantage）
和傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，本試劑盒的無(wú)縫克隆技術(shù)有多方面的優(yōu)勢(shì)：
（1）操作更簡(jiǎn)單，只需要一次反應(yīng)即可完成；
（2）對(duì)酶切位點(diǎn)無(wú)要求，可以把目的片段插入到任意載體的任意位點(diǎn)；
（3）連接片段之間不會(huì)引入任何多余的序列，是真正的無(wú)縫克隆；
（4）陽(yáng)性克隆率高，降低克隆篩選的工作量。
儲(chǔ)存條件（Storage）
于-20℃避光保存12個(gè)月，避免反復(fù)凍融。
運(yùn)輸方式（Shipping）
干冰運(yùn)輸。
Note
For research use only .
使用方法（Standard Operating Procedure）icon
1.線性化載體的制備
線性化載體制備的兩種方法：（1）在目標(biāo)載體質(zhì)粒上選取合適的位點(diǎn)，進(jìn)行單酶切或者雙酶切，酶切后割膠純化；（2）反向PCR擴(kuò)增載體，在線性化位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)的引物，進(jìn)行擴(kuò)增。
圖2.線性化載體制備的兩種方法
注意：載體質(zhì)粒單酶切容易造成載體切割不完全和載體自連，導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，所以盡可能的選擇雙酶切。請(qǐng)務(wù)必割膠回收線性化的載體，否則殘余的環(huán)狀質(zhì)粒會(huì)產(chǎn)生背景菌落。一般回收后的線性化載體濃度需要>15ng/µl。
2. 目的基因片段的制備
設(shè)計(jì)引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增：
（1）PCR引物必須包含兩個(gè)部分，引物的5"端必須包含與載體末端完全同源的15-25bp堿基，引物的3’端必須包含靶基因特意引物序列。
（2）每條引物的3’端必須具有目的基因特異性，長(zhǎng)度為15-25bp，GC%為40%-60%，退火溫度Tm為58℃-65℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)跑膠，割膠純化待用。
（3）當(dāng)有多個(gè)片段插入時(shí)，首片段和末尾片段引物的5"端必須包含與載體末端完全同源的15-25bp堿基。其余中間片段引物的5"端必須包含與前一個(gè)片段15bp左右同源序列，3"端必須包含與后一個(gè)片段15bp左右同源序列。
3.反應(yīng)體系的設(shè)置
參考下表在冰上配制重組反應(yīng)體系：
| 2 ×Master Mix | 5 µl |
| Linearized vector | 50-200ng |
| Purified PCR Fragment | 20-200ng |
| Total | 10 µl |
反應(yīng)條件：插入單個(gè)片段，一般需50℃反應(yīng)30min；隨著插入片段的增多，長(zhǎng)度的加大，反應(yīng)時(shí)間隨之延長(zhǎng)，一般需要45-60min。
注意：線性化載體與目的片段的加入量可以根據(jù)各自的濃度，片段的長(zhǎng)度自行調(diào)整。目的片段與線性化載體的摩爾比在3:1左右，過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低重組效率。
4.轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的鑒定
（1）取100μl待轉(zhuǎn)化感受態(tài)，置于冰上解凍。
（2）向上述感受態(tài)細(xì)胞懸浮液中加入10μl重組好的反應(yīng)液（按第3步操作），輕輕混勻，不能震蕩，將該混合物置于冰上30 min。
（3）在42℃的水浴中熱激90 sec，立即置于冰上保存2 min，再加入500 μl LB培養(yǎng)基（不含抗性），37 ℃搖床200rpm震蕩培養(yǎng)1h左右。
（4）取上述轉(zhuǎn)化混合液200-300μl，涂布在選擇性固體培養(yǎng)基上（含相應(yīng)抗生素），待菌液被培養(yǎng)基充分吸收后，將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
（5）挑平板上的克隆進(jìn)行菌落PCR，或提質(zhì)粒雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆。
組分&說(shuō)明（Component & Instruction）icon
| 樣品名稱 | 規(guī)格 | 描述 | 推薦儲(chǔ)存條件 |
| 預(yù)包板 | 1 板 | 96孔聚苯乙烯微孔板（12列*8孔），預(yù)包被RBD 蛋白。 | 密封狀態(tài)放置于-20℃保存。 |
| 陽(yáng)性對(duì)照 | 1 管 | 12μL陽(yáng)性對(duì)照，臨用前用樣本稀釋液1:100 稀釋至工作濃度。 | 放置于-20℃保存。 |
| 陰性對(duì)照 | 1 管 | 60μL陰性對(duì)照，臨用前用樣本稀釋液1:10 稀至工作濃度。 | 放置于-20℃保存。 |
| 檢測(cè)溶液A | 1 管 | 12μL HRP標(biāo)記 ACE2 蛋白（含防腐劑），臨用前用檢測(cè)溶液稀釋液1:2000稀釋至工作濃度。 | 放置于-20℃保存。 |
| 樣本稀釋液 | 1 瓶 | 25 mL稀釋液（含防腐劑），用于陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、血清、血漿的稀釋。 | 放置于4℃保存。 |
| 檢測(cè)溶液稀釋液 | 1 瓶 | 25 mL稀釋液（含防腐劑），用于檢測(cè)溶液A的稀釋。 | 放置于4℃保存。 |
| 濃縮清洗液 | 1 瓶 | 25 mL （20×）濃縮清洗液（含防腐劑），臨用前用去離子水1:20稀釋至工作濃度。 | 放置于4℃保存。 |
| 顯色液 | 1 瓶 | 12 mL TMB（四甲基聯(lián)苯胺）。 | 放置于4℃保存。 |
| 終止液 | 1 瓶 | 6 mL 2M 酸液。 | 放置于4℃保存。 |
| 封板膜 | 4 片 | 用于實(shí)驗(yàn)中封閉酶標(biāo)板。 | 放置于常溫保存。 |
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