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中文名稱：人缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA）

英文名稱： Human HIF1α（HIF1α） ELISA KIT

定量檢測血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清和組織等樣本中的人缺氧誘導(dǎo)因子1α （HIF1α）濃度。

1. 檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。在預(yù)包被抗人缺氧誘導(dǎo)因子1α （HIF1α）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入人缺氧誘導(dǎo)因子1α （HIF1α）標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本，再加入另一株HRP標(biāo)記的抗人缺氧誘導(dǎo)因子1α （HIF1α）抗體（HRP標(biāo)記抗體），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-HRP標(biāo)記抗體的夾心復(fù)合物。加入顯色底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色。在酶標(biāo)儀450nm波長上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中人缺氧誘導(dǎo)因子1α （HIF1α）的濃度正相關(guān)。擬合標(biāo)準(zhǔn)品曲線，可以計算出樣本中人缺氧誘導(dǎo)因子1 α （HIF1α）的濃度。

2. 試劑盒檢測的局限

1）僅供科研使用，不得用于臨床診斷

2）請在本試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用。

3）試劑盒的試劑不能與其他批號的試劑或其他來源的試劑混合使用。

4）任何操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、孵育溫度、試劑盒保存時間的改變，都將影響結(jié)合反應(yīng)。

5）本試劑盒在設(shè)計上去除或降低了生物學(xué)樣本中的一些內(nèi)源性干擾因素，并非所有可能的影響因素都已經(jīng)去除。

1. 試劑盒提供的材料

組分	48孔配置	96孔配置	備注
預(yù)包被酶標(biāo)板	48T	96T	無
標(biāo)準(zhǔn)品	0.3mL*6管	0.3mL*6管	無
稀釋液	3 ml	6 ml	無
HRP 標(biāo)記抗體	5 ml	10 ml	無
顯色底物 A	3 ml	6 ml	無
顯色底物 B	3 ml	6 ml	無
終止液	3 ml	6 ml	無
20×洗液	25 ml	25 ml	按說明書進行操作
封板膜	2張	2張	無
說明書	1份	1份	無
自封袋	1個	1個	無

備注：

1）標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：4000、 2000、 1000、 500、 250、 125 pg/mL。

2）經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進行適當(dāng)稀釋后再進行實驗。

3）盒子拆封后必須在一個月內(nèi)使用完；試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染；相關(guān)試劑在分裝時會比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些，具體含量以實際收到的實物為主。

2. 未提供的材料設(shè)備

1）能夠檢測 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀

2）移液器及槍頭、加樣槽

3）3.37℃恒溫箱或水浴鍋

4）準(zhǔn)備試劑用的試管、離心管、量筒等

5）蒸餾水或去離子水

6）渦旋振蕩器、微孔板振蕩器

3.貯存

試劑盒保存于 2 - 8℃，有效期標(biāo)注于標(biāo)簽上（有效期一般是6個月）。只有恰當(dāng)保存的試劑才是有保證的。如果試劑盒的組分需要再次使用，請確保上一次使用之后沒有被污染。

未開封試劑盒	貯存于 2 - 8℃。請在有效期內(nèi)使用。
打開的試劑盒或重組試劑	顯色底物A	在 2 - 8℃，大約可以貯存 3個月。
	顯色底物B	在 2 - 8℃，大約可以貯存 3個月。
	終止液	在 2 - 8℃，大約可以貯存 3個月。
	20×洗液	在 2 - 8℃，大約可以貯存 3個月。
	樣本稀釋液	在 2 - 8℃，大約可以貯存 3個月。
	標(biāo)準(zhǔn)品	在 2 - 8℃，大約可貯存 14天。
	HRP 標(biāo)記抗體	在 2 - 8℃，大約可貯存 14天。
	預(yù)包被酶標(biāo)板	未使用的板條請放回鋁箔袋，封好封口。在 2 - 8℃，大約可貯存 1 4天。

4.注意事項

1）所有的化學(xué)試劑理應(yīng)被認為具有潛在危害。

2）推薦只有經(jīng)過良好實驗室培訓(xùn)的工作人員方可操作本試劑盒。操作時請佩戴合適的防護設(shè)施，例如白大衣、乳膠手套、安全眼鏡等。3）請避免試劑接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。

4）試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護服，及防護眼睛、手及面部的設(shè)施。

5）本試劑盒用于科學(xué)研究，不能用于診斷治療。

6）請不要使用過期的試劑。

7)在試劑盒的貯存或孵育過程請避免強光照射。

8)在操作試劑盒或處理樣本時請佩戴乳膠或一次性手套。

9)為了避免微生物的污染，以及試劑與樣本間的交叉污染，請使用一次性槍頭。

10)使用干凈的容器配制試劑。

11)試劑的準(zhǔn)備必須使用蒸餾水或去離子水。

12)顯色底物在使用之前必須平衡至室溫。

13)液體廢棄物的處理。不含酸的液體廢棄物，加入 1.0 %的次氯酸鈉，浸泡 30 分鐘。含酸的液體廢棄物，請先中和，再加入次氯酸鈉。

5.技術(shù)要點

1)加校準(zhǔn)品與樣本時，每個校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。

2)在應(yīng)用自動洗板機時，加入洗液之后，設(shè)置 30 秒的浸泡程序，或者在不同的洗滌步驟將微孔板掉轉(zhuǎn) 180 度，這樣可以提高分析的準(zhǔn)確度。

3)為保證結(jié)果的精確性，孵育時封好封板膜。

4)顯色底物在添加之前應(yīng)是無色的。保持顯色底物始終處于避光態(tài)。

5)終止液的添加順序應(yīng)與顯色底物的添加順序相同。

6)添加終止液之后，底物的顏色應(yīng)由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。如果底物呈現(xiàn)綠色，說明終止液與顯色底物沒有充分混勻。

7）在任何情況下，避免接觸微孔板的內(nèi)表面。

8）實驗中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

1.樣本采集與貯存

細胞培養(yǎng)上清

2000 × g條件下離心20m分鐘，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復(fù)凍融。

血清樣本

離心管收集血清。血樣凝集 30 分鐘后，2000 × g 離心 10 分鐘。吸取血清樣本之后即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存，避免反復(fù)凍融。

血漿樣本

EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本。2000 × g 離心 20 分鐘收集樣本。即刻檢測，或者分裝，-20℃以下貯存，避免反復(fù)凍融。

組織樣本

用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎或反復(fù)凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清測。

細胞提取液樣本

貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS 洗滌3次。每 1×106 個細胞中加入150-200μL PBS重懸并通過反復(fù)凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。

注意：

1）避免樣本的反復(fù)凍融，在檢測前，冷凍樣本應(yīng)緩慢地恢復(fù)至室溫，輕柔混勻。

2）本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本，但是未充分驗證。

2.試劑準(zhǔn)備

1）用前，所有的組分都要至少復(fù)溫30min，確保充分復(fù)溫到室溫。

2）濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

3.檢測步驟

1）試劑、樣本平衡：檢測之前請將所有的試劑、樣本平衡至室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。配置工作液：按前面試劑準(zhǔn)備中描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2）加標(biāo)準(zhǔn)品、樣本：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，樣本孔加待測樣本50μL，空白孔不加。

3）加 HRP標(biāo)記抗體：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100μL。

4）孵育：使用封板膜封板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60分鐘。

5）洗滌：棄掉液體，每孔加入300μL洗液洗板，靜置20s，洗滌5次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實驗性能，必須徹底移除殘留液體。

6）加底物顯色：每孔加入50μL顯色底物A、B 各50μL，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15分鐘。

7）加終止液：每孔加入50μL終止液。顏色由藍色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕叩擊板框，充分混勻。

8）檢測讀數(shù)：在 15分鐘之內(nèi)，使用450nm酶標(biāo)儀進行檢測讀數(shù)。

4.廢物處理

所有使用或未使用的試劑，所有污染性的一次性材料，應(yīng)當(dāng)遵循傳染性或潛在傳染性產(chǎn)品的處理程序，每個實驗室都有責(zé)任根據(jù)其實驗的類型和危險性級別，進行廢物和污物的處理，同時要嚴(yán)格依照有關(guān)規(guī)定對待所有的廢物和污物。

1.結(jié)果計算

1）復(fù)孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔平均值可作為測量值。

2）每個標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。

3）檢測完成后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標(biāo)，利用計算機軟件，采用多項式曲線擬合，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

4）如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度。

（示意圖，僅供參考）

2.試劑盒的性能

1）物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無破損漏氣。

2)劑量反應(yīng)曲線線性標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.99。

3)精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于8%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批間變異系數(shù)CV%小于12%。

4）檢測范圍

125 pg/mL – 4000 pg/mL

5)靈敏度

最低可檢測濃度為10 pg/mL。

6)特異性

本試劑盒識別天然和重組人缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）。

7)穩(wěn)定性

2℃-8℃保存，有效期6個月。

由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。

1. 最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

2. 不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。

3. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。

4. 本公司只對試劑盒本身負責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。

5. 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實驗結(jié)果偏差。

6. 若樣本為細胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。

7. 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。

For research use only .

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