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1.仔細閱讀使用說明書。

2.提前從冰箱拿出標記試劑盒各組分平衡至室溫。

3.用180μL組分B溶解組分A管中的生物素，充分溶解配制成10mM的生物素工作液

4.按照生物素標記使用量計算所需添加生物素的量。

標記使用生物素量的計算:標記程度取決于蛋白質上氨基的分布、蛋白濃度和所用試劑的量。實驗分析表明待標記蛋白或抗體的濃度在2mg/mL的時候，需使用20倍蛋白或抗體摩爾數的生物素;而當低于1mg/mL的時候，則需要加入更高摩爾倍數的生物素，以確保蛋白或抗體分子中生物素的標記水平。

 

用以下公式計算需要加入生物素的摩爾量:

mL protein x (mg protein/mLprotein) x (mmol protein/mg protein) x (mmol Biotin/mmol protein) x 20= mmol Biotin

然后計算需要多少微升10mM的生物素:

mmol Biotinx(1000000μL/L)x(L/10mmol)= μL Biotin

 

例:有1mL 2mg/mL的lgG溶液要標記，則需要加入~27uL10mM的Sulfo-NHS-LC-Biotin。

1mL lgG x 2mg/mL lgG x (1mmol lgG/150000 mg lgG) x (1mmol Biotin/1mmol lgG)x 20= 0.000267 mmol Biotin

0.000267 mmol Biotinx(1000000uL/L)x(L/10mmol)= 26.7uL Biotin

1.取1mg 待標記抗體于組分C超濾管中，并加入相應體積的組分B，使抗體的終濃度為 2mg/mL。如果抗體濃度過低可以通過超濾離心濃縮至2mg/mL左右。如果待標記物含有游離的氨基(Tris,氨基酸或者其他干擾物)，需要用組分B反復超濾確保其被去除干凈;

2.加入13.3μL生物素(10mM)工作液和適量組分B至上述超濾管中，使終體積為 0.5ml，并輕輕吹打混勻。恒溫37℃孵育 30min，期間可每隔10min吹打一次。(10mM生物素工作液最好一次性使用);

3.標記到這一步已完成，盡管溶液中仍有過量未反應的和水解的生物素試劑，已經可以用 ELISA和 Western blot 實驗初步測試標記蛋白；

4.加入適量組分B至上述超濾管中，6000rpm離心10min。重復此操作至少4次;

5.收集超慮管中的溶液(即生物素標記的抗體)。加入等量組分D保存至-20℃C冰箱或三分之二的組分D保存至-80℃冰箱中。

1.本試劑盒適用于所有含伯氨(-NH2)的大分子物質的標記(蛋白，抗體，多肽及其他含有伯氨基團根據其分子量大小和標記程度選擇合適的量);

2.本試劑盒配備了標記物保存液組分D，其中主要成分為甘油?？蛻粢部梢愿鶕粯擞浳锏奶攸c和用途不同，選擇更適合自己實驗的保存液;

3.本試劑盒未開封前的有效期為12個月，請在有效期內使用,

4.本系列試劑盒提供的超濾管組分C為10KDa截留分子量和0.5mL的最大容積，客戶需要根據自己要標記的物質的分子量大小和標記量選擇合適的超慮管?；蛘咛崆奥?lián)系我們以便提供您所需的超慮管規(guī)格;

5.10mM生物素工作液配置好后，最好一次性使用。剩余部分最多可在-20℃保存周，偶聯(lián)效率可能降低。