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概述（Summary）
產(chǎn)品英文名（Product Name）
TUNEL Apoptosis Detection Kit（Fluorescein-12）
產(chǎn)品中文名
TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(Fluorescein-12)
產(chǎn)品描述（Description）細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本的生物學(xué)現(xiàn)象，如核質(zhì)固縮，線粒體膜電位消失，通透性改變，細(xì)胞間連接消失，DNA降解等。細(xì)胞在凋亡發(fā)生時，會激活一些相關(guān)內(nèi)切酶類，這些酶會切斷核小體間的基因組DNA，這種特異且有規(guī)律的DNA降解在經(jīng)DNA電泳檢測時，則會呈現(xiàn)180-200bp的DNA梯度條帶，而壞死的細(xì)胞DNA則呈彌散性條帶。TUNEL(rTdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細(xì)胞凋亡的原理，即基因組DNA斷裂時，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Recombinant Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, rTdT)的催化下加上綠色熒光素標(biāo)記的FITC-12-dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
本公司生產(chǎn)的TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒（Fluorescein-12）是一款靈敏性高，可檢測到單細(xì)胞水平的凋亡現(xiàn)象，同時可檢測到早期凋亡；快速簡便，只需將固定好的細(xì)胞或組織經(jīng)染色及洗滌后，即可置于熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀下進(jìn)行檢測，整個實驗操作僅需1-2小時。另外，本試劑盒應(yīng)用范圍廣泛，不僅可用于冰凍切片和石蠟切片的凋亡檢測，還可用于貼壁或懸浮細(xì)胞的凋亡檢測。
儲存條件（Storage）
儲存于-25 ~ -15℃， Fluorescein-12-dUTP Nucleotide Mix避光保存于-20 oC。
運(yùn)輸方式（Shipping）
冰袋運(yùn)輸。
Note
For research use only .
使用方法（Standard Operating Procedure）
1.實驗前準(zhǔn)備
（1）磷酸緩沖液PBS；
（2）溶于PBS的4%多聚甲醛固定液，pH7.4；
（3）溶于PBS的0.1% Triton X-100；
（4）如需染核，需備DAPI（2 μg/ml）或PI（1 μg/ml）；
（5）如需設(shè)置陽性對照組，需備DNase I Buffer及DNase I；
（6）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2.樣品預(yù)處理
2.1 細(xì)胞樣品
（1）細(xì)胞爬片或者涂片經(jīng)PBS洗滌5分鐘后，用溶于PBS的4%多聚甲醛液室溫固定30分鐘；
（2）PBS洗滌5分鐘；
（3）用含0.1% Triton ? X-100的PBS溶液，37℃濕盒通透10-15分鐘；
（4）PBS洗滌3次，每次5分鐘；
注意：細(xì)胞涂片要做好方脫處理。
2.2 組織切片
2.2.1 石蠟切片
（1）室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中脫蠟10-20分鐘，換用新鮮的二甲苯再脫蠟10-20分鐘，重復(fù)1-2次；
（2）室溫下用100%乙醇浸泡切片5分鐘，重復(fù)2次；
（3）室溫下用梯度乙醇（95%、80%、70%）各浸泡切片1次，每次5分鐘；
（3）PBS浸泡、洗滌5分鐘；
注意：在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。
（4）配制Proteinase K工作液：按1:9體積比，用PBS作為稀釋液，至終濃度為0.2 μg/μl；
（5）每個樣本上滴加100 μl Proteinase K工作液覆蓋樣本，37℃濕盒通透15-20分鐘；
注意：Proteinase K幫助組織和細(xì)胞進(jìn)行染色劑的通透，孵育時間過長會導(dǎo)致組織或細(xì)胞從切片上脫落，過短則造成通透性處理不充分影響后續(xù)標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，可以優(yōu)化Proteinase K的孵育時間。
（6）PBS洗滌3次，每次5分鐘；處理后樣本放置在濕盒中保持樣本濕潤。
注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。
2.2.2 冰凍切片
（1）將玻片短暫回溫后浸沒在溶于PBS的4%多聚甲醛溶液中，室溫孵育30分鐘。
（2）玻片從固定液中取出后，置于通風(fēng)櫥中自然晾干；
（3）將玻片放入純水或PBS浸泡、洗滌3-5分鐘；
（4）每個樣本上滴加100 μl Proteinase K工作液覆蓋樣本，37℃濕盒通透15-20分鐘；
（5）PBS洗滌3次，每次5分鐘；處理后樣本放置在濕盒中保持樣本濕潤。
3. 陽性樣本和陰性樣本的處理（可選）
（1）陽性對照組：加入10 U/ml的DNase I；
（2）陰性對照組：加入等體積1× DNase I Buffer；
（3）所有分組均加入1×DNase I Buffer并完全覆蓋樣本表面，37℃濕盒孵育30分鐘。
（4）去掉多余的液體并將玻片用去離子水徹底洗滌3-4次。
4. 染色標(biāo)記
TUNEL檢測液配置表：

注意：TUNEL檢測液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍融。
（1）按1:9的比例，用ddH2O稀釋10x Equilibration Buffer為1x Equilibration Buffer，備用；
（2）按照表格比例配置TUNEL檢測液，每組切片滴加適量的TUNEL檢測液使其完全覆蓋（針對涂片、切片或者96孔板，48孔板、24孔板及12孔板，一般50μl TUNEL檢測液可足夠用于大小約為2.5*2.5cm的樣本），注意不能干片且要避光；
（3）將玻片置于37℃濕盒避光孵育1-2h；注意孵育過程不要干片；
（4）立即用PBS溶液潤洗3-4次，每次5分鐘；
（5）在黑暗環(huán)境中將玻片浸入PI溶液（1μg/ml）的染色缸或DAPI溶液（2μg/ml），室溫放置8分鐘（可選）；
（6）用PBS清洗玻片3次，每次5分鐘；
（7）用濾紙吸凈玻片多余液體，用抗熒光猝滅封片劑封片。
注意：封片前可向樣本區(qū)域加100μl含有抗熒光淬滅劑、20%甘油的PBS保持樣本濕潤。
5. 觀察檢測
熒光顯微鏡下觀察，注意避光。PI/DAPI能將凋亡/未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位綠色熒光。
6. 流式細(xì)胞術(shù)檢測懸浮細(xì)胞
（1）將3.0-5.0×10 6個細(xì)胞用PBS洗2次，每次4℃，1500rpm離心10分鐘；
（2）用0.5 ml PBS重懸細(xì)胞；
（3）固定細(xì)胞：加入溶于PBS的4%多聚甲醛固定液1 ml，冰上放置30分鐘；
（4）4℃，1500rpm離心5分鐘，去上清；
（5）1 ml PBS重懸細(xì)胞，4℃，1500rpm離心5分鐘，去上清并用0.5 ml PBS重懸；
（6）用1 ml含0.1% Triton ? X-100的PBS溶液通透細(xì)胞或用0.2μg/μl的protein k溶液工作液通透細(xì)胞，室溫放置5分鐘；
（7）1500rpm離心5分鐘，棄上清，用1 ml PBS重懸細(xì)胞；
（8）轉(zhuǎn)移細(xì)胞至一個新的1.5 ml微量離心管，1500rpm離心5分鐘，去上清；
（9）用80 μl 1x Equilibration Buffer重懸，室溫孵育30分鐘；
（10）1500rpm離心10分鐘，去上清；
（11）將細(xì)胞沉淀重懸在50 μl TUNEL檢測液（參照TUNEL檢測液配置表），37℃避光孵育1-2h，每隔15min用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞；
（12）反應(yīng)完成后加入1 ml 20mM EDTA終止反應(yīng)，用微量移液器輕輕混勻；
（13）1500rpm離心10分鐘，去上清并把細(xì)胞沉淀用0.5 ml PI溶液（1μg/ml）重懸，避光孵育30分鐘；
（14）流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。 測量495-520nm波段Fluorescein-12-dUTP的綠色熒光和>620 nm波段PI的紅色熒光。
7.常見問題及注意事項
（1） 熒光高背景
1.FITC被非特異性摻入，整個操作過程需保證樣品的濕潤；
2.高速分裂或增殖的細(xì)胞，有時也會出現(xiàn)細(xì)胞核DNA斷裂；
3.TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)?？梢杂迷噭┖刑峁┑膔TdT酶稀釋液稀釋rTdT酶2-5倍后再操作。稀釋后的rTdT酶需當(dāng)日使用完畢；
4.支原體污染。利用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染；
（2） 熒光信號弱
1.Triton X-100通透或者蛋白酶K作用不充分，可調(diào)整通透劑的濃度和孵育時間；
2.熒光淬滅，熒光劑需避光保存和使用；
3.由于凋亡細(xì)胞貼壁性減弱，因此在操作過程中應(yīng)輕柔操作避免細(xì)胞丟失；
（3）出現(xiàn)非特異性標(biāo)記
1.有些細(xì)胞和組織里的DNA酶活性比較高，易導(dǎo)致非特異性標(biāo)記。解決辦法是取完細(xì)胞或組織后立即對其進(jìn)行充分固定，阻止酶活；
2.操作過程中可能混入DNA酶的污染。

組分&說明（Component & Instruction）