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- 產(chǎn)品名稱： SARS-CoV-2 Surrogate Virus Neutralization Test Kit(K417N,E484K,N501Y)
- 產(chǎn)品貨號： CSK00018
- 貨期： 現(xiàn)貨
- 價格與訂購： 2880
- 數(shù)量：
庫存： 100
- 規(guī)格：
- 產(chǎn)品信息
- 如何訂購
所需設(shè)備及試劑
450 nm濾光片酶標儀，含540 nm或570nm校正波長更佳
單道或多道微量移液器，移液器槍頭
去離子水
500 mL量筒
樣品稀釋管或不同規(guī)格EP管
吸水紙
一、樣品收集與儲存
處理所有的血液和血清，請按照NCCLS提供的處理和儲存血清和血漿樣本的建議（1990年H18-A批準的血液樣本處理和處理標準程序）。
血清樣本：全血室溫放置60分鐘或4℃過夜，然后1000 x g離心15分鐘，取上清檢測，或分裝后于≤-20℃冰箱保存，避免樣品反復(fù)凍融。
血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝劑收集血漿，樣品采集后30分鐘內(nèi)1000 x g離心15分鐘，取上清檢測，或分裝后于≤-20℃冰箱保存，避免樣品反復(fù)凍融。
二、試劑準備
使用前將所有試劑和樣本置于室溫平衡。
20×濃縮清洗液：如果濃縮清洗液中有晶體析出，平衡至室溫并搖勻，直到晶體完全溶解，25mL濃縮清洗液使用去離子水定容至500mL，得到清洗液。
待測樣本：將待測樣本用樣本稀釋液按照體積比1:9稀釋，例如10μL樣本加入90μL樣本稀釋液。
陽性對照：臨用前震蕩混勻后用掌上離心機瞬時離心，使液體集中于管底，使用樣本稀釋液1:100稀釋至工作濃度。
陰性對照：臨用前震蕩混勻后用掌上離心機瞬時離心，使液體集中于管底，使用樣本稀釋液1:10稀釋至工作濃度。
檢測溶液A（HRP標記）：臨用前震蕩混勻后用掌上離心機瞬時離心，使液體集中于管底，使用檢測溶液稀釋液1:2000稀釋至工作濃度。
顯色液：避光保存，顯色時100μL /孔。室溫下孵育8?10分鐘。
終止液：顯色完畢后50μL /孔。
三、實驗步驟
使用前將所有試劑和樣本置于室溫，建議對所有標準品、對照品和樣本進行一式兩份的分析。
1. 按照前面章節(jié)的指示準備所有試劑和樣本。
2. 從板架上取下多余的微孔板條，將其放回裝有干燥劑包的鋁箔袋中，然后重新密封保存于-20℃。
3. 將稀釋的陽性對照、陰性對照和待測樣本分別與檢測溶液A按照 1:1等體積混合。例如，將100μL陽性對照與100μL檢測溶液A混合，該步驟可在96孔PCR板或者96孔Elisa板中進行。
4. 將陽性對照混合物、陰性對照混合物和待測樣本混合物各100μL添加到對應(yīng)的酶標板孔中，用封板膜蓋好，37℃孵育1小時。
5. 棄去孔內(nèi)液體，每孔加入 300μL的清洗液，輕微震蕩后棄去孔內(nèi)液體，將酶標板倒扣在吸水紙上輕拍，使殘留在孔內(nèi)的液體全部去除，重復(fù)洗板 5 次，此過程也可采用尖嘴噴射瓶，多道移液器或自動洗板機來完成。
6. 每孔加入100μL顯色液，37℃避光顯色8-10分鐘。
7. 每孔加入50μL終止液，孔里的顏色應(yīng)該由藍色變至黃色，如果孔內(nèi)顏色為綠色或顏色變化不均勻，輕輕震動酶標板使顏色均一。
8. 擦干酶標板底部水氣，立刻用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的O.D.值，如果波長校正可用，則設(shè)置為540 nm或570 nm，如果波長校正不可用，則從450 nm的讀數(shù)中減去540 nm或570 nm的讀數(shù)，這種修正可去除酶標板讀數(shù)中的光學(xué)偏差，如果沒有校正波長，可直接讀取450 nm的讀數(shù)，但讀值有可能不準確。
四、結(jié)果判讀
為確保結(jié)果的有效性，每次檢測必須包括陽性和陰性對照，陽性對照和陰性對照檢測OD450必須在下表所列的范圍內(nèi)，如果OD450值不符合下表要求，則試驗無效，必須重復(fù)進行。
| 項目 | OD450值 | 結(jié)果判斷 |
| 陽性對照 | ＜ 0.3 | 通過 |
| 陰性對照 | ＞0.9 | 通過 |
用抑制率來判定樣本中抗SARS-CoV-2中和抗體的水平，判定公式如下：
五、判定閾值
| 項目 | 閾值 | 結(jié)果 | 檢測結(jié)果判讀 |
| 中和抗體檢測 | ≥20% | 陽性 | 檢測到中和抗體 |
| ＜20% | 陰性 | 未檢測到中和抗體 |
六、精密度
批內(nèi)差：CV<8%
批間差：CV<10%
七、穩(wěn)定性
試劑盒按推薦溫度保存6個月，信號強度降低小于 10%。
八、實驗細節(jié)說明
1. 在試劑盒標簽上的有效期內(nèi)使用，不要與其他廠家的試劑盒混合使用。
2. 如果陰性對照或陽性對照檢測OD值超出檢測范圍，可適當縮短顯色時間。
3. 為避免交叉污染，不同標準品、樣本、試劑的加樣需更換移液槍頭，每管試劑使用單獨的容器儲存。
4. 在孵育過程中貼緊封板膜。
5. 顯色液避光保存，臨用前15分鐘從冰箱取出室溫平衡。
6. 濃縮清洗液（20×）需使用去離子水1：20稀釋至工作濃度，去離子水不包含在試劑盒中，需實驗人員自備。
7. 終止液為酸性溶液，具有輕微腐蝕性，使用時避免接觸皮膚、眼、耳、口等暴露部位，如不慎接觸，使用大量清水沖洗后觀察接觸部位反應(yīng)，如情節(jié)嚴重請及時就醫(yī)。
8. 試劑盒酶標板條可按需拆卸使用，已開封的試劑盒建議在1個月內(nèi)使用，未開封的試劑盒所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存，收到試劑盒后請將陰性對照、陽性對照、檢測溶液 A以及 96 孔板保存于-20℃，其余試劑請置于 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>
九、常見問題解決指南
| 問題 | 可能原因 | 解決方案 | |
| 陽性質(zhì)控讀數(shù)低或者異常 | 檢測溶液A和預(yù)包板失活 | a. | 增加反應(yīng)時間或檢測試劑濃度以補償可能喪失的活性 |
| 儀器設(shè)置錯誤 | a. a.
| 檢查儀器設(shè)置 | |
| b. | 提前一小時預(yù)熱酶標儀 | ||
| 加樣錯誤 | a. | 檢查加樣步驟 | |
| 試劑過早提前準備 | a. | 確保工作液現(xiàn)配現(xiàn)用 | |
| 溫度不穩(wěn)定
| a. | 孵育時間和溫度參見說明書，避免反復(fù)凍融
| |
| 讀數(shù)背景高 | 樣品中含有抑制劑
| a. | 加入空白孔 |
| b. | 保證DMSO < 1% | ||
| 洗滌不完全 | a. | 增加洗滌次數(shù)和洗液量 | |
| 緩沖液樣品污染、降解
| a. | 確保正確準備，使用和存儲了緩沖液和樣品
| |
| 讀數(shù)不穩(wěn)定 | 移液或稀釋方法不一致 | a. | 校正移液器
|
| b.
| 準備預(yù)混液以減少移液不一致 | ||
| c. | 設(shè)置平行孔以獲得更準確的結(jié)果 | ||
| 孔中有氣泡 | a. | 輕震酶標板以去除氣泡
| |
| 讀數(shù)過高 | a. | 調(diào)整樣品濃度以達到最佳信號強度。
| |
| b. | 孵育時間調(diào)整至45分鐘
| ||
| 試劑和樣品混合不充分 | a. | 確保試劑與樣品完全混合
| |
| 顯色不完全 | 緩沖液殘留或污染
| a. | 陰性對照中的顏色應(yīng)在添加TMB底物后10秒鐘內(nèi)出現(xiàn)。 如未按上述時間顯色可考慮以下情況： a.在添加TMB之前確保沒有污染或殘留的緩沖液 b.延長TMB孵育時間到15分鐘 |
| 樣品名稱 | 規(guī)格 | 描述 | 推薦儲存條件 |
| 預(yù)包板 | 1 板 | 96孔聚苯乙烯微孔板（12列*8孔），預(yù)包被RBD(K417N,E484K,N501Y)蛋白。 | 密封狀態(tài)放置于-20℃保存。 |
| 陽性對照 | 1 管 | 12μL /管陽性對照，臨用前用樣本稀釋液1:100 稀釋至工作濃度。 | 放置于-20℃保存。 |
| 陰性對照 | 1 管 | 60μL /管陰性對照，臨用前用樣本稀釋液1:10 稀釋至工作濃度。 | 放置于-20℃保存。 |
| 檢測溶液A
| 1 管 | 12μL/管-HRP標記 ACE2 蛋白（含防腐劑），臨用前用檢測溶液稀釋液1:2000稀釋至工作濃度。 | 放置于-20℃保存。 |
| 樣本稀釋液 | 1 瓶 | 25 mL稀釋液（含防腐劑），用于待測樣本的稀釋。 | 放置于4℃保存。 |
| 檢測溶液稀釋液 | 1 瓶 | 25 mL稀釋液（含防腐劑），用于檢測溶液A的稀釋。 | 放置于4℃保存。 |
| 濃縮清洗液 | 1 瓶 | 25 mL （20×）濃縮清洗液（含防腐劑），臨用前用去離子水1:20稀釋至工作濃度。 | 放置于4℃保存。 |
| 顯色液 | 1 瓶 | 12 mL TMB（四甲基聯(lián)苯胺）。 | 放置于4℃保存。 |
| 終止液 | 1 瓶 | 6 mL 。 | 放置于4℃保存。 |
| 封板膜 | 3 片 | 用于實驗中封閉酶標板。 | 放置于常溫保存。 |
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