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- 產(chǎn)品名稱： 熒光素Fluor680標(biāo)記試劑盒
- 產(chǎn)品貨號： CSL0580
- 貨期： 現(xiàn)貨
- 價(jià)格與訂購： 2800
- 數(shù)量：
庫存： 100
- 規(guī)格： 一盒
- 產(chǎn)品信息
- 如何訂購
Fluor熒光染料為活性熒光染料，該系列包括從紫外、可見光譜到近紅外光譜常見熒光染料，用于標(biāo)記生物分子，特別是蛋白質(zhì)和核酸。對核心結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新性修改使得Fluor染料優(yōu)于具有許多創(chuàng)新新穎特征的其他商業(yè)染料，主要表現(xiàn)在標(biāo)記效率更高，發(fā)光度更強(qiáng)。
Fluor680是一種熒光染料，其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為683nm和700nm，它與抗體形成更特異的抗體熒光素結(jié)合物，背景較更低。cy5.5升級產(chǎn)品。
基本原理
本試劑盒主要通過熒光素集團(tuán)的活性鍵與生物分子的游離氨基共價(jià)結(jié)合，可以用于標(biāo)記抗體，蛋白。本試劑盒種所提供的熒光染料都為預(yù)先活化干粉，便于長期保存，使用時(shí)用試劑盒隨帶的DMSO溶解便可直接用于標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，60-90分鐘可以輕松完成標(biāo)記。標(biāo)記產(chǎn)物在含有防腐劑的保存液中可以放置在 4?C至少保存1個(gè)月以上，需要長期保存。
本試劑盒常被用于抗體的直接標(biāo)記，省卻了二抗的使用和其所帶來的操作步驟。
試劑盒組分
| 組分名稱（Components） | 型號規(guī)格及其對應(yīng)組分 | |||
| ARL0580K-200 | ARL0580K-500 | ARL0580K-1000 |
其他規(guī)格可洽定制 | |
| 可標(biāo)記抗體量 | 0.2~1.0mg | 0.5~2.5mg | 1.0~5.0mg | |
| 活化Fluor680干粉 | 使用時(shí)加DMSO 40ul溶解 | 使用時(shí)加DMSO 100ul溶解 | 使用時(shí)加DMSO 200ul溶解 | |
| DMSO | 40ul | 100ul | 200ul | |
| 標(biāo)記緩沖液(Coupling buffer) | 10mL | 15mL | 30mL | |
| 標(biāo)記物保存液(Preservation Buffer) | 2.0mL | 2mL*2 | 10mL | |
| 純化超濾管: | 1支 | 1支 | 1支 | |
重要提示：
1. 本試劑盒所配置的活化Fluor680熒光染料為干粉，可放置4?C或者-20?C長期保存，使用時(shí)加入試劑盒所配的DMSO溶解即可用于標(biāo)記，溶解后的Fluor680熒光染料不可保存下次使用，建議一次性使用完；
2. 本試劑盒所配置的超濾管默認(rèn)截留30k MWCO,適合于抗體抗體，如果需要標(biāo)記其他分子量蛋白類物質(zhì)請與我們聯(lián)系，給您配置相應(yīng)分子量截留超濾管（您的待標(biāo)記物質(zhì)分子量必須大于超濾管截留分子量的2倍以上）；
3. 本試劑盒所推薦的抗體標(biāo)記量僅供參考，如有更高要求需要實(shí)驗(yàn)者具體摸索優(yōu)化，建議按照推薦最低量進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
4. 對待標(biāo)記抗體、蛋白質(zhì)的要求：
ü 待標(biāo)記物以0.01M pH7.4 PBS環(huán)境為佳，不應(yīng)含有甘油、BSA、疊氮鈉、氨基物質(zhì)（包括甘氨酸、Tris 等），EDTA等物質(zhì)。如果含有以上小分子物質(zhì)，需用0.01M pH7.4 PBS 緩沖溶液進(jìn)行充分透析、脫鹽柱脫鹽或者超濾管超濾置換溶液以除去干擾小分子，如果含有保護(hù)性蛋白BSA等需要想辦法將其分離去除；
ü 調(diào)整待標(biāo)記物至適當(dāng)?shù)臐舛?，抗體調(diào)整的濃度為2-10mg/mL為宜；對于小分子物質(zhì)需要實(shí)驗(yàn)者摸索濃度，保證熒光素的比例過量。
ü 最佳標(biāo)記反應(yīng)條件為試劑盒所提供的標(biāo)記緩沖液環(huán)境，盡可能在標(biāo)記前將待標(biāo)記物溶液環(huán)境置換為標(biāo)記還緩沖液；
ü 如果待標(biāo)記物溶液中有不溶物、有塊狀物或者沉淀請離心或者過濾除掉。
其他需要自備材料：
ü 待標(biāo)記的生物分子
ü 移液器及吸頭.
ü 去離子水.
ü PBS (pH 7.4)
試劑盒儲存
試劑盒放在-20?C可保存6個(gè)月以上。.
常見問題及解決辦法
Q: 待標(biāo)記分子經(jīng)過濃縮濃度仍然達(dá)不到2 mg/ml，再濃縮就產(chǎn)生沉淀了怎么辦?
A: 標(biāo)記的時(shí)候盡可能達(dá)到這個(gè)濃度，如果實(shí)在達(dá)不到這個(gè)濃度，適當(dāng)增加加入的活化的熒光素的量；最佳標(biāo)記效果可以梯度增加熒光素用量試驗(yàn)測試來確定。
Q: 待標(biāo)記分子與熒光素的最佳摩爾比只能是1:8 - 1:22之間？
A: 這個(gè)要根據(jù)不同生物分子性質(zhì)確定，更準(zhǔn)確的說與生物分子表面氨基個(gè)數(shù)有關(guān)系；最佳標(biāo)記比例可根據(jù)梯度用量測試確定。
Q: 如果選擇標(biāo)記試劑盒中的超濾管型號?
A: 一般來說，您待標(biāo)記生物分子的分子量是超濾管截留分子量的2倍以上最好；比如，標(biāo)記抗體，抗體分子量為150Kd,選擇分子截留75kD以下的都可以，分子量截留越小，超濾越慢。如果分子量太小，標(biāo)記完以后建議用更高精度的純化方式，比如，10kD分子量建議用HPLC純化
試劑盒使用操作流程
? 試劑準(zhǔn)備
待標(biāo)記的生物分子與熒光素最佳摩爾比例為1:8-1:22,本試劑盒推薦最佳比例為1:15（按照本試劑盒操作熒光素干粉加入相應(yīng)量DMSO溶解后的熒光素濃度770uM(nmol/ml),通常1mg/ml抗體(分子量150kDa)的濃度為6.67uM(nmol/ml)； 為了獲得最佳的摩爾比例，可以要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。以抗體標(biāo)記為例，推薦量如下。最佳標(biāo)記體系應(yīng)保證抗體的濃度為2mg/ml，標(biāo)記時(shí)終濃度不低于1mg/ml。對于其他標(biāo)記量，參照表按等比例調(diào)整抗體的體積和用量。
? 樣品準(zhǔn)備
待標(biāo)記的分子濃度不低于2 mg/ml，如果濃度較低，需在實(shí)驗(yàn)之前濃縮到2mg/ml以上；待標(biāo)記的分子需要溶解在符合以下要求的緩沖液中，如果符合以下要求可以直接進(jìn)行標(biāo)記，如果不符合請將溶液置換（透析或者超濾）到符合要求的溶液中在進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
| pH | 6.5-8.0 |
| 不含游離氨基 | MES, PBS, HEPES |
| 螯合劑 (e.g. EDTA) | ü |
| 甘油 | < 5% |
| 牛血清白蛋白 | ? |
| 甘氨酸 | ? |
| 含氨基組分 | ? |
? 操作流程(以標(biāo)記100ug抗體為例,2mg/ml)
1) 將待標(biāo)記抗體溶液置換成標(biāo)記緩沖液，或者加入1/10體積標(biāo)記緩沖液，用移液器輕輕混勻；
2) 取20ul(按照抗體與熒光素摩爾比=1:23)活化的Fluor680溶液加入到上述步驟混勻的抗體中，輕輕混勻，37℃ 避光反應(yīng)1小時(shí)；
3) 反應(yīng)完畢，將適量的PBS（約450uL）加入到步驟2)的混合溶液中，輕輕混勻并將溶液移至超濾管芯，4℃ 12000離心5min；
4) 離心完畢，取出管芯將外套管內(nèi)溶液棄掉，管芯重新插入外套管，在管芯內(nèi)重新加入適量的PBS（約450uL）4℃ 12000離心5min；
5) 重復(fù)步驟4）5次以上；
6) 將超濾管芯內(nèi)溶液輕輕混勻并吹打管心內(nèi)壁，并轉(zhuǎn)移到干凈避光離心管，此即為熒光素標(biāo)記產(chǎn)物。
? 標(biāo)記產(chǎn)物的保存
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整到合適的濃度，可加入適量BSA，甘油及防腐劑等，分裝成小分-20℃避光保存；也可以將試劑盒附帶的標(biāo)記物保存液與標(biāo)記產(chǎn)物按照體積比1：1混勻后，即可分裝保存。
Flour 680標(biāo)記蛋白F/P值計(jì)算：
1）用PBS 精確倍數(shù)稀釋定量的少許純化過的偶聯(lián)蛋白，在1cm比色皿中測定280nm和680nm的光吸收；
2）計(jì)算樣品中的蛋白濃度：蛋白摩爾濃度=(A280-(A650×0.05))×稀釋倍數(shù)/203000
3）計(jì)算標(biāo)記比例： 每摩爾蛋白結(jié)合的染料摩爾數(shù)=A650×稀釋倍數(shù)/(184000×蛋白摩爾濃度)
常見問題及解決辦法
Q: 待標(biāo)記分子經(jīng)過濃縮濃度仍然達(dá)不到2 mg/ml，再濃縮就產(chǎn)生沉淀了怎么辦?
A: 標(biāo)記的時(shí)候盡可能達(dá)到這個(gè)濃度，如果實(shí)在達(dá)不到這個(gè)濃度，適當(dāng)增加加入的活化的熒光素的量；最佳標(biāo)記效果可以梯度增加熒光素用量試驗(yàn)測試來確定。
Q: 待標(biāo)記分子與熒光素的最佳摩爾比只能是1:8 - 1:22之間？
A: 這個(gè)要根據(jù)不同生物分子性質(zhì)確定，更準(zhǔn)確的說與生物分子表面氨基個(gè)數(shù)有關(guān)系；最佳標(biāo)記比例可根據(jù)梯度用量測試確定。
Q: 如果選擇標(biāo)記試劑盒中的超濾管型號?
A: 一般來說，您待標(biāo)記生物分子的分子量是超濾管截留分子量的2倍以上最好；比如，標(biāo)記抗體，抗體分子量為150Kd,選擇分子截留75kD以下的都可以，分子量截留越小，超濾越慢。如果分子量太小，標(biāo)記完以后建議用更高精度的純化方式，比如，10kD分子量建議用HPLC純化
Q:標(biāo)記效率低
A:有以下原因：
1）緩沖液中含有痕量伯銨成分，與染料反應(yīng)降低了標(biāo)記效率。如果蛋白已經(jīng)溶于含氨基的緩沖液（如Tris或氨基乙酸），標(biāo)記前用PBS透析。
2）蛋白含量較低 (≤1 mg/mL)會影響標(biāo)記效率。
3）標(biāo)記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應(yīng)混合物的pH升高至～8，因?yàn)樵谌鯄A性環(huán)境中標(biāo)記反應(yīng)的效率最高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH，加入重碳酸鹽也無法將pH調(diào)節(jié)至最適水平。要么加大重碳酸鹽的量，要么將緩沖液換成PBS，或用0.1 M碳酸氫鈉透析等。
4）研究顯示pH升至9.0～9.4，標(biāo)記效率和標(biāo)記速度（只需10min）明顯改善。
5）不同抗體與熒光團(tuán)的反應(yīng)速率不同，染料標(biāo)記后保留的生物活性程度也不同，因此標(biāo)準(zhǔn)步驟也不是總有最好的標(biāo)記結(jié)果。為增加標(biāo)記率，可以對同一樣品進(jìn)行再標(biāo)記，或減少蛋白的量加大染料的量重新標(biāo)記。有研究者在室溫孵育1小時(shí)后再4℃孵育過夜，情況有所改善。
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