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- 產(chǎn)品名稱： cGMP ELISA Kit
- 產(chǎn)品貨號： CS80103
- 貨期： 現(xiàn)貨
- 價(jià)格與訂購： 3800
- 數(shù)量：
庫存： 100
- 規(guī)格： 96TEST
- 產(chǎn)品信息
- 如何訂購
產(chǎn)品描述
環(huán)磷酸鳥苷（鳥苷-3′,5′-環(huán)化一磷酸，cGMP）在許多生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。cGMP由鳥苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生，而被磷酸二酯酶降解，因此激活鳥苷酸環(huán)化酶或者抑制磷酸二酯酶可以提高細(xì)胞內(nèi)cGMP的含量。研究發(fā)現(xiàn)，cGMP特異性磷酸二酯酶的抑制劑可用于治療人類疾病，如cGMP特異性磷酸二酯酶第5類型(如偉哥和西力士)可用于治療勃起功能障礙等疾病。
因此為篩選出腺苷酸環(huán)化酶的激活劑或磷酸二酯酶的抑制劑，需要一個(gè)高敏感度、特異性的、可重復(fù)的方案用于檢測cGMP的含量?？紤]到大分子的化合物可能存在較弱的影響，這一個(gè)初篩是有必要的。
目前商業(yè)化提供的一些cGMP檢測試劑盒主要使用的是非親和純化的cGMP多克隆抗體。盡管據(jù)稱有特異性，但這些多克隆抗cGMP抗體與cAMP和GTP呈現(xiàn)一定程度的交叉反應(yīng)。且在大多數(shù)細(xì)胞類型中，cGMP含量低于cAMP 100倍。
紐斯特生物的cGMP ELISA 檢測試劑盒使用的是獨(dú)一無二的鼠單克隆抗cGMP抗體，該單克隆抗cGMP抗體的特異性比cAMP、GTP等類似的小分子高出108 倍以上。相較于其他的多克隆抗體cGMP試劑盒，紐斯特生物cGMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性，且能有效避免來自動物多克隆抗體的批次間差異， 因此可以提供長久有效地可重復(fù)性定量檢測。
此外，其他ELISA試劑盒的多克隆抗cGMP抗體與乙?；痗GMP的親和力明顯高于非乙?；痗GMP，而本試劑盒的單克隆cGMP抗體與乙?；蚍且阴；痗GMP具有同樣的親和力。因此，紐斯特生物cGMP ELISA試劑盒中的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品不需要乙?；幚?，從而明顯縮短了分析時(shí)間，有效避免了乙?；^程中的有機(jī)試劑的使用，為大家提供了一個(gè)更安全、更健康的工作環(huán)境。
工作原理
本試劑盒利用競爭酶聯(lián)免疫分析方法來測定細(xì)胞提取物或體外鳥苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cGMP的水平。簡而言之，將羊抗鼠抗體包被在酶標(biāo)板上，細(xì)胞提取物或體外鳥苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cGMP與固定數(shù)量的偶聯(lián)辣根過氧化物酶的cGMP競爭性的結(jié)合抗cGMP單克隆抗體，已知的cGMP作為標(biāo)準(zhǔn)品來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過一段時(shí)間孵育，洗掉所有試劑，加入底物進(jìn)行顯色。將多孔板置于酶標(biāo)儀上，于450nm波長下，進(jìn)行讀數(shù)。黃光強(qiáng)度與樣品中cGMP的濃度呈反比關(guān)系?；赾GMP標(biāo)準(zhǔn)品所得曲線，通過測得的光密度可以計(jì)算出樣品中cGMP的濃度。
研究背景
cGMP作為獨(dú)特的第二信使，可調(diào)節(jié)細(xì)胞對各種外源和內(nèi)源信號分子的反應(yīng)。 cGMP主要通過激活蛋白激酶、控制特定的離子通道、磷酸二酯酶調(diào)節(jié)細(xì)胞環(huán)核苷酸濃度來調(diào)節(jié)不同的生理過程（8），如血管平滑肌松弛、上皮細(xì)胞電解質(zhì)運(yùn)輸、骨生長、白細(xì)胞遷移、軸突引導(dǎo)、精子運(yùn)動、血小板蔓延以及血管通透性等（1-9）。
通過鳥苷酸環(huán)化酶可以實(shí)現(xiàn)GTP轉(zhuǎn)化為cGMP。在哺乳動物中，存在2種類型的鳥苷酸環(huán)化酶:可溶性及膜結(jié)合的鳥苷酸 環(huán)化酶(8,10,11)?？扇苄原h(huán)化酶在一氧化氮與血紅素輔基結(jié)合后，即被激活。七層膜結(jié)合鳥苷酸環(huán)化酶（即跨膜鳥苷酸環(huán)化酶或鳥苷酸環(huán)化酶微粒）已被證實(shí)存在于人類基因組中，鳥苷酸環(huán)化酶A和B是利尿鈉肽受體，鳥苷酸環(huán)化酶C能被熱穩(wěn)定細(xì)菌腸毒素、鳥苷素和脲激活。跨膜鳥苷酸環(huán)化酶的活性亦受胞內(nèi)信號通路的其他受體信號所調(diào)控。（12）
試劑盒組成材料
1. 羊抗小鼠IgG包被的96孔微孔板，1張， Catalog No. CS30101
該微孔板是將特異性識別小鼠IgG 的山羊抗體包被于可拆分酶標(biāo)條上
2. cGMP偶聯(lián)的辣根過氧化物酶， 6mL， Catalog No.CS 30102
本包裝含1000×偶聯(lián)酶儲存液和稀釋緩沖液。
注意：為了穩(wěn)定和長效的實(shí)驗(yàn)，抗體儲存于-80℃。在使用前將6μL 1000×偶聯(lián)酶儲存液加入到6mL 稀釋緩沖液中配制為工作液，并輕輕混勻。
工作液請避免反 復(fù)凍融。
3. cGMP的小鼠單克隆抗體， 6mL， Catalog No. CS26001-2
本包裝含1000×抗體儲存液和稀釋緩沖液。
注意：為了穩(wěn)定和長效的實(shí)驗(yàn)，抗體儲存于-80℃。在使用前將6μL 1000×抗體加入到6mL 稀釋緩沖液中配制為工作液，并輕輕混勻。工作液請避免反復(fù)凍融。
4. 中和液， 6mL， Catalog No. CS30103
5. 10×濃縮洗滌液， 15mL， Catalog No. CS30106
含去污劑的磷酸鹽緩沖液。
6. cGMP標(biāo)準(zhǔn)品， 0.25mL， Catalog No. CS30114
cGMP濃度5000pmol/ mL
7. 顯色底物A，10 mL， Catalog No. CS30107
8. 顯色底物B， 10mL， Catalog No. CS30108
9. 終止液，6mL， Catalog No. CS30110
注意：該溶液有腐蝕性；儲存時(shí)請旋緊瓶蓋
試劑盒儲存要求
本試劑盒所有組分在有效期限內(nèi)，于4℃穩(wěn)定保存。為了長效的實(shí)驗(yàn)，1000×儲液請保存于-80℃。
本試劑盒未提供的必需試劑
去離子水或蒸餾水。
濃鹽酸。
量程在5μL至1000μL之間的精密移液管。
量程為50μL和200μL的中繼移液器。
用于稀釋儲液的一次性燒杯。
刻度量筒。
微孔板振蕩器。
吸水紙。
酶標(biāo)儀，可讀波長450nm，在570nm至590nm之間應(yīng)有修正。
樣品處理
該ELISA試劑盒適用于檢測經(jīng)過鹽酸處理而終止內(nèi)源性磷酸二酯酶活性的cGMP樣品。這種樣品可直接應(yīng)用于檢測，而不需要汽化和進(jìn)一步的處理。
組織樣品
組織樣本需預(yù)先冰凍于液氮中。在不銹鋼研缽中用液氮將組子樣本研磨成精細(xì)粉末。待液氮揮發(fā)完后，稱量冰凍組織樣本并加入10倍體積的0.1M HCl混勻。室溫以大于600g離心力離心，取上層清夜用0.1M HCl稀釋至適當(dāng)濃度。
細(xì)胞樣品對于生長的組織培養(yǎng)液中的細(xì)胞，首先移除培養(yǎng)基，然后加入0.1M HCl處理細(xì)胞。孵育10分鐘并觀察細(xì)胞是否被裂解；如果裂解不充分，接著孵育10分鐘并觀察。以大于600g離心力于室溫離心，收集上清直接用于實(shí)驗(yàn)。臨用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%濃度的Triton-x 100可增強(qiáng)細(xì)胞和組織裂解。在這個(gè)濃度范圍內(nèi)，去污劑并不干擾試驗(yàn)的結(jié)合部位，但是會適度的增加光密度值。含有Triton的樣品需利用標(biāo)準(zhǔn)曲線估計(jì)濃度，為了最精確的測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線需以相同方式稀釋。取1 mL細(xì)胞培養(yǎng)上清加入10μL濃鹽酸，600g離心力于室溫離心，上清液直接用于實(shí)驗(yàn)測定培養(yǎng)基中cGMP。
注意步驟
在使用前，將所有試劑放置30分鐘，平衡至室溫。
用試劑預(yù)先潤洗槍頭在使用；取各種樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和試劑必需更換槍頭。
移取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品到微孔底部。
從微孔的邊緣加入試劑，以避免污染。
該試劑盒使用可拆分的微孔酶標(biāo)條，使用者可根據(jù)樣品量多少進(jìn)行拆分。未使用的酶標(biāo)條保持干燥，密封于試劑盒提供的鋁封袋中，于4℃保存。微孔酶標(biāo)條需安裝在相應(yīng)的框架上使用。
在加入顯色底物前，確保微孔內(nèi)沒有殘留的洗滌液。微量殘留的洗滌液可能導(dǎo)致分析結(jié)果的變化。
試劑準(zhǔn)備
非乙?；痗GMP標(biāo)準(zhǔn)品將5000 pmol/mL cGMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液平衡至室溫。從#1至#7標(biāo)記六只潔凈試管。移取475μL 0.1M HCl到#1號試管，400μL到#2至#7號試管。加入 25μL 5000 pmol/mL cGMP標(biāo)準(zhǔn)品到#1管中，劇烈渦旋震蕩。從#1管中取出100μL溶液至#2管中，渦旋震蕩。以此類推，重復(fù)上步操作，梯度稀釋至#7管。
經(jīng)以上操作，#1至#6管中cGMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為250,50，10,2,0.4，0.08和0.016 pmol/mL（詳見cGMP加樣表）。稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品需在30分鐘內(nèi)使用。
標(biāo)記一只試管作為無標(biāo)準(zhǔn)品空白對照（NSB）。移取600μL 0.1M HCl到NSB管中。
洗滌液將15 mL 10×洗滌液儲液加到135 mL去離子水中，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限，或者3個(gè)月。
實(shí)驗(yàn)步驟
使用前將各種試劑取出放置30分鐘，平衡至室溫。所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必需設(shè)置平行對照實(shí)驗(yàn)。
快速加入試劑至樣品中，立即漩渦震蕩2秒混勻。
依據(jù)加樣表決定酶標(biāo)條的使用量，將剩余的酶標(biāo)條連同干燥劑一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存。
移取50μL中和液至各個(gè)微孔中，除了TA(總活性)孔和Blank(空白)孔。
移取100μL 0.1M HCl至NSB(非特異結(jié)合)孔和B0孔(0 pmol/mL cGMP標(biāo)準(zhǔn)品)。
移取100μL cGMP標(biāo)準(zhǔn)品至相應(yīng)的孔。
移取100μL樣品至相應(yīng)的孔。
移取50μL 0.1M HCl至NSB(非特異結(jié)合)孔。
移取50μL 偶聯(lián)酶至各孔中，除了TA(總活性)孔和Blank(空白)孔。
移取50μL 抗體工作液至個(gè)孔中，除了TA(總活性)孔、Blank(空白)孔和NSB(非特異結(jié)合)孔。
將酶標(biāo)孔置于孔板振動器上，250~500rpm，室溫孵育2小時(shí)。
在吸水紙上拍干微孔內(nèi)溶液，加洗滌液400μL每孔洗3次，每次需拍干。
最后一次洗滌，清空各微孔，在干凈的無塵吸水紙上輕巧酶標(biāo)板數(shù)次，以確保沒有洗滌液殘留。
加5μL 偶聯(lián)酶至TA(總活性)孔。
每孔200μL顯色底物溶液，于室溫靜置5~30分鐘。（顯色底物A和B需在臨用前15分鐘內(nèi)等體積混合，并避光放置。）
每孔加入50μL終止液。終止后立即讀數(shù)。
清除酶標(biāo)儀Blank(空白)孔值，讀取405nm處的光密度值，在570nm至590nm之間最好有修正。如果酶標(biāo)儀不能自動清除Blank(空白)孔值，那么手動扣除每個(gè)讀數(shù)的Blank(空白)孔光密度值。
結(jié)果計(jì)算
樣品中cGMP濃度有多種計(jì)算方法。X軸表示cGMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度，Y軸表示凈光密度的平均值或者百分比值。
樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的凈光密度(OD)平均值的計(jì)算：
凈OD平均值 = OD平均值 － NSB孔OD平均值
計(jì)算不同梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合率占最大結(jié)合率(B0孔)的百分比，計(jì)算公式如下：
百分比值 = (凈OD平均值/ B0孔OD平均值)×100
繪制凈OD平均值或百分比值對cGMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度的Logit-Log曲線。通過插值即可得到樣品中cGMP濃度。
標(biāo)準(zhǔn)曲線
下面的曲線不能用于計(jì)算cGMP濃度。每次實(shí)驗(yàn)需新做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
靈敏度
通過比較10個(gè)B0孔平均光密度值(OD)和10個(gè)#6管標(biāo)準(zhǔn)品的平均光密度值，計(jì)算出靈敏度。cGMP濃度的檢測極限通過標(biāo)準(zhǔn)曲線上0位置的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差來測定。
線性關(guān)系
cGMP濃度為16.0pmol/mL的樣品，用0.1M HCl進(jìn)行連續(xù)七次1:2梯度稀釋。將實(shí)際的cGMP濃度和測定的cGMP濃度繪制圖表。該直線的斜率為1.000，相關(guān)系數(shù)為0.999。
交叉反應(yīng)
部分相關(guān)化合物的交叉反應(yīng)由競爭ELISA測定。將可能的交叉反應(yīng)物溶解到試劑盒分析緩沖液中，濃度從500 pmol/mL至500,000 pmol/mL。將這些樣品用該試劑盒測定，實(shí)測cGMP濃度以50%B/Bo進(jìn)行計(jì)算。交叉反應(yīng)的%通過比較檢測到的交叉反應(yīng)物濃度和實(shí)際的反應(yīng)物濃度得到，并以百分比的形式表示。
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